Znane są sekwencje genomowe większości wirusów.Sondy kwasu nukleinowego, które są krótkimi segmentami DNA zaprojektowanymi do hybrydyzacji z komplementarnymi segmentami wirusowego DNA lub RNA.Reakcja łańcuchowa polimerazy (PCR) jest bardziej wydajną techniką wykrywania wirusów.W ostatnim czasie opracowano wysokowydajne metody diagnostyczne.
A. Technika hybrydyzacji kwasów nukleinowych
Hybrydyzacja kwasów nukleinowych, obejmująca głównie Southern blotting (Southern) i Northern blotting (Northern), jest szybko rozwijającą się nową techniką w dziedzinie diagnostyki wirusów.Uzasadnieniem testu hybrydyzacji jest użycie krótkich segmentów DNA (zwanych „sondą”) zaprojektowanych do hybrydyzacji z komplementarnymi segmentami wirusowego DNA lub RNA.Przez ogrzewanie lub obróbkę alkaliczną, dwuniciowy docelowy DNA lub RNA rozdziela się na pojedyncze nici, a następnie unieruchamia na stałym podłożu.Następnie sonda jest dodawana i hybrydyzowana z docelowym DNA lub RNA.Ponieważ sonda jest znakowana izotopem lub nieradioaktywnym nuklidem, docelowy DNA lub RNA można wykryć za pomocą autoradiografii lub układu biotyna-awidyna.Ponieważ większość genomów wirusowych została sklonowana i zsekwencjonowana, można je wykryć za pomocą sekwencji specyficznych dla wirusa jako sond w próbce.Obecnie metody hybrydyzacji obejmują: dot blot, hybrydyzację in situ w komórkach, hybrydyzację DNA (DNA) (Southern blot) i hybrydyzację RNA (RNA) (Northern blot).
Technologia B.PCR
W ostatnich latach opracowano serię technik amplifikacji kwasów nukleinowych in vitro, opartych na PCR, do testowania niewrażliwych lub niehodowlanych wirusów.PCR to metoda, w której można zsyntetyzować określoną sekwencję DNA w reakcji polimerazy in vitro.Proces PCR obejmuje cykl termiczny składający się z trzech etapów: denaturacji, wygrzewania i wydłużania W wysokiej temperaturze (93 ℃ ~ 95 ℃) dwuniciowy DNA jest rozdzielany na dwie pojedyncze nici DNA;następnie w niskiej temperaturze (37 ℃ ~ 60 ℃) dwa zsyntetyzowane startery nukleotydowe przyłączają się do komplementarnych segmentów DNA;podczas gdy w temperaturze odpowiedniej dla enzymu Taq (72℃), synteza nowych łańcuchów DNA zaczyna się od startera 3', używając komplementarnego DNA jako matrycy i pojedynczych nukleotydów jako materiałów.Tak więc po każdym cyklu jeden łańcuch DNA może zostać zamplifikowany do dwóch łańcuchów.Powtarzając ten proces, każdy łańcuch DNA zsyntetyzowany w jednym cyklu może być użyty jako matryca w następnym cyklu, a liczba łańcuchów DNA jest podwajana w każdym cyklu, co oznacza, że produkcja PCR jest wzmacniana z prędkością 2n log.Po 25 do 30 cyklach produkcja PCR jest identyfikowana za pomocą elektroforezy, a specyficzne produkty DNA można obserwować w świetle UV (254 nm).Ze względu na swoistość, czułość i wygodę, PCR został zastosowany w diagnostyce klinicznej wielu infekcji wirusowych, takich jak HCV, HIV, CMV i HPV.Ponieważ PCR jest bardzo czuły, może wykryć DNA wirusa na poziomie fg, operację należy przeprowadzić bardzo ostrożnie, aby uniknąć fałszywie dodatniego wyniku.Ponadto dodatni wynik testu kwasu nukleinowego nie oznacza, że w próbce znajduje się żywy zakaźny wirus.
Dzięki szerokiemu zastosowaniu techniki PCR powstają nowe techniki i metody oparte na technice PCR dla różnych celów testowych.Na przykład ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym może wykryć obciążenie wirusem;PCR in situ służy do identyfikacji infekcji wirusowej w tkance lub komórkach;Zagnieżdżony PCR może zwiększyć specyficzność PCR.Wśród nich szybciej opracowano ilościowy PCR w czasie rzeczywistym.Wiele nowych technik, takich jak sonda do hydrolizy TaqMan, sonda do hybrydyzacji i sonda molekularna, zostało połączonych w technikę ilościowego PCR w czasie rzeczywistym, która jest szeroko stosowana w badaniach klinicznych.Oprócz dokładnej identyfikacji miana wirusa w płynach ustrojowych pacjentów, metoda ta może być również stosowana do wykrywania mutantów tolerujących leki.Dlatego ilościowa reakcja PCR w czasie rzeczywistym jest stosowana głównie w ocenie efektów leczniczych i kontroli tolerancji leków.
C. Wysokoprzepustowe wykrywanie wirusowych kwasów nukleinowych
Aby sprostać potrzebom szybkiej diagnozy nowych pojawiających się chorób zakaźnych, opracowano różne wysokoprzepustowe metody wykrywania, takie jak chipy DNA (DNA).W przypadku chipów DNA, specyficzne sondy są syntetyzowane i przyłączane do małych chipów krzemowych z bardzo dużą gęstością, tworząc mikromacierz sond DNA (DNA), którą można hybrydyzować z próbką.Sygnał hybrydyzacji można zobrazować za pomocą mikroskopu konfokalnego lub skanera laserowego, a następnie przetworzyć komputerowo i uzyskać ogromny zbiór danych dotyczących różnych genów.Istnieją dwa rodzaje chipów DNA.„Chip syntezy” jest następujący: specyficzne oligonukleotydy są syntetyzowane bezpośrednio na chipach.Innym jest chip puli DNA.Sklonowane geny lub produkty PCR są kolejno drukowane na szkiełku.Zaletą technologii chipów DNA jest jednoczesne wykrywanie ogromnej ilości sekwencji DNA.Najnowsza wersja chipa do wykrywania patogenów może jednocześnie zidentyfikować ponad 1700 ludzkich wirusów.Technologia chipów DNA rozwiązała problemy tradycyjnych metod hybrydyzacji kwasów nukleinowych i ma bardzo szerokie zastosowanie w diagnostyce wirusów i badaniach epidemiologicznych.
Czas posta: 23.12-2020